Uji Identifikasi Protein

Salting Out

Salting Out adalah Peristiwa adanya zat terlarut tertentu yang mempunyai kelarutan lebih besar dibanding zat utama, akan menyebabkan penurunan kelarutan zat utama atau terbentuknya endapan karena ada reaksi kimia. Contohnya : kelarutan minyak atsiri dalam air akan turun bila kedalam air tersebut ditambahkan larutan NaCl jenuh.

Pengendapan pada metode salting-out terjadi karena proses persaingan antara garam dan protein untuk mengikat air. Grup ion pada permukaan protein menarik banyak molekul air dan berikatan dengan sangat kuat. Contohnya Amonium sulfat yang ditambahkan ke dalam larutan protein akan menyebabkan tertariknya molekul air oleh ion garam. Hal tersebut disebabkan ion garam memiliki densitas muatan yang lebih besar dibandingkan protein. Kekuatan ionic garam pada konsentrasi tinggi semakin kuat sehingga garam dapat lebih mengikat molekul air. Menurunnya jumlah air yang terikat pada protein menyebabkan gaya tarik menarik antara molekul protein lebih kuat bila dibandingkan dengan gaya tarik menarik anatara molekul protein dan air (mempertinggi interaksi hidrofobik), sehingga protein akan mengendap dari larutan atau berikatan dengan kolom hidrofobik. Selama proses salting-out, konsentrasi garam harus tetap dijaga agar tidak menurun dalam larutan sehingga tidak terjadi pengendapan yang bersamaan antara protein yang ingin dimumikan dan protein yang tidak diinginkan.

Pengendapan protein dengan penambahan garam

Pengendapan protein dengan cara penambahan garam didasarkan pada pengaruh yang berbeda daripada penambahan garam tersebut pada kelarutan protein globuler (Wirahadikusumah, 1981). Lebih lanjut Thena wijaya (1987) menjelaskan bahwa pada umunya dengan meningkatnya kekuatan ion, kelarutan protein semakin besar, tetapi setelah mencapai titik tertentu kekuatannya justru akan semakin menurun. Pada kekuatan ion rendah gugus protein yang terionisasi dikelilingi oleh ion lawan sehingga terjadinya interaksi antar protein, dan akibatnya kelarutan protein akan menurun. Jenis garam netal yang biasa digunakan untuk pengendapan protein adalah magnesium klorida, magnesium sulfat, natrium sulfat, dan ammonium sulfat.

titik isoelektrik adalah pH pada saat protein memiliki kelarutan terendah dan mudah membentuk agregat dan mudah diendapkan (Sudarmadji, 1996). Berbagai protein globular mempunyai daya kelarutan yang berbeda di dalam air. Variable yang mempengaruhi kelarutan ini dalah pH, kekuatan ion, sifat  dielektrik pelarut dan temperature. Setiap protein mempunyai pH isoelektrik, dimana pada pH isoelekrik tersebut molekul protein mempunyai daya kelarutan yang minimum. Thenawijaya (1987) menjelaskan bahwa perubahan pH akan mengubah ionisasi gugus fungsional protein, yang berarti pula mengubah muatan protein. Protein akan mengendap pada titik isoelektiknya, yaitu titik yang menunjukkan muatan total protein sama dengan nol (0), sehingga interaksi antar protein menjadi maksimum.

Masukkan 100 cc susu ke dalam gelas kimia, lalu campurkan 100 cc air. Diaduk terus-menerus sambil diteteskan larutan HCl 10% hingga terlihat keping-keping dalam cairan itu, yaitu kasein yang mengendap pada titik -isoelektrik pH 4,7. Tambahkan asam yang berlebih, kasein larut kembali. Biarkan air tersebut selama 10 menit. Lalu tuangkan cairan itu ke dalam gelas kimia lainnya, sehingga sisanya yang masih ada disaring ( kasein dan cairan ).

Titik isolistrik pada albumin adalah pada pH 4,55-4,90 (Poedjiadi, 1994).

Seperti asam amino, protein yang larut dalam air akan membentuk ion yang mempunyai muatan positif dan negatif. Dalam suasana asam molekul protein akan membentuk ion positif, sedangkan dalam suasana basa akan membentuk ion negatif. Pada titik isolistrik protein mempunyai muatan positif dan negatif yang sama, sehingga tidak bergerak ke arah elektroda positif maupun negatif apabila ditempatkan di antara kedua elektroda tersebut. Protein mempunyai titik isolistrik yang berbeda-beda. Titik isolistrik protein mempunyai arti penting karena pada umumnya sifat fisika dan kimia erat hubungannya dengan pH isolistrik ini. Pada pH di atas titik isolistrik protein bermuatan negatif, sedangkan di bawah titik isolistrik, protein bermuatan positif. Adanya gugus amino dan karboksil bebas pada ujung-ujung rantai molekul protein, menyebabkan protein mempunyai banyak muatan (polielektrolit) dan bersifat amfoter (dapat bereaksi dengan asam maupun basa). Daya reaksi berbagai jenis protein terhadap asam dan basa tidak sama, tergantung dari jumlah dan letak gugus amino dan karboksil dalam molekul. Dalam larutan asam (pH rendah), gugus amino bereaksi dengan H⁺, sehingga protein bermuatan positif. Sebaliknya, dalam larutan basa (pH tinggi) molekul protein akan bereaksi sebagai asam atau bermuatan negatif. Pada pH isolistrik muatan gugus amino dan karboksil bebas akan saling menetralkan sehingga molekul bermuatan nol (Winarno, 2002).

Pengendapan protein oleh garam

Larutan albumin dalam air dapat diendapkan dengan penambahan amoniumsulfat ((NH4)2SO4) hingga jenuh (Poedjiadi, 1994). Setelah larutan albumin dijenuhkan dengan (NH4)2SO4, uji kelarutan endapan yang terjadi dengan air menunjukkan hasil positif (endapan larut membentuk butiran). Kemudian butiran direaksikan dengan pereaksi milon, dan bereaksi positif dengan ditandai endapan berwarna kemerahan. Uji filtrat dengan pereaksi biuret juga menunjukkan hasil poisitif yang ditandai larutan berwarna ungu violet. (Poedjiadi, 1994).

Apabila kadalam larutan protein ditambahkan larutan garam-garam anorganik dengan konsentrasi tinggi, maka kelarutan protein akan berkurang sehingga membentuk endapan. Proses ini terjadi karena adanya kompetisi antara molekul protein dengan ion anorganik dalam mengikat air (hidrasi). (Sumardjo 1998)

Credit: :

http://eviaws.blogspot.com/2011/03/pengendapan-protein-oleh-garam.html

http://fuadrruddin91.student.umm.ac.id/2011/08/11/presipitasi-protein-salting-in-dan-salting-out/

http://darmaqua.blogspot.com/2008/04/amino-dan-protein.html

:: http://soerjauan.blogspot.com/2012/02/sifat-fisika-kimia-metode-pemisahan.html

http://makalahkumakalahmu.net/2008/11/07/prosedur-kerja-untuk-pengendapan-protein-dan-penentuan-protein/